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武漢科銳諾生物科技有限公司
主營：外泌體,透射電鏡,掃描電鏡,石蠟切片等技術服務
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原位雜交雜交液注意事項：
（1）雜交液內除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血1清白蛋白及載體DNA或RNA等。
（2）雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標本之間的靜電結合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。，所以雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達到提高雜交率的目的（尤其對雙鏈核酸探針）。
在雜交液中加入牛血1清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，以減低背景。
熒光原位雜交技（fish）原理：是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態和分布，或者是結合了熒光探針的DNA區域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。
熒光原位雜交技（fish）實驗步驟：
1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。
2、脫水：組織固定完成后經梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。
3、切片：石蠟經切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。
4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-無水乙醇Ⅰ 5min-無水乙醇Ⅱ 5min，風干，DEPC水浸泡。
5、消化：根據組織固定時間長短，切片于修復液中煮沸10分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA試劑，花芽原位雜交測試服務，避光室溫反應5min。后TBST洗3次×10min，PBS洗1次×5min。
DAPI復染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片1劑封片。
鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FAM(488)綠光激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3紅光激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光。）
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第4年
