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根據核酸探針標記物的種類分別進行自顯影或利用酶檢測系統進行不同顯色處理。細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定,如自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀(computer-assisted image analysis)檢測銀粒的數量和分布的差異。非性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統顯色,原位雜交技術,然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數量的核酸的顯色強度進行檢測。

在ISHH,整個實驗周期是比較長的,實驗程序也比較繁雜,而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此,雜交是ISHH中關鍵的而且是重要的一個環節。雜交是將雜交液滴于切片組織上,加蓋硅化的蓋玻片,防止孵育過程中的高溫(50℃左右)導致雜交液的蒸發。為保證雜交所需的濕潤環境,原位雜交公司,可將其放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standard saline citrate,原位雜交, SSC)溶液的硬塑料盒中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同,所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。

原位雜交技術的技術流程

原位雜交技術的技術流程包括樣本處理、探針制備、雜交反應和信號檢測等步驟。樣本處理包括組織或細胞的固定、包埋、切片和脫氧核糖核酸酶消化等步驟,目的是保持組織或細胞的原始結構和核酸序列的完整性。探針制備包括標記探針、純化和變性等步驟,目的是提高探針的特異性和敏感性。雜交反應包括預雜交、雜交和洗脫等步驟,目的是使探針與目標核酸序列形成雙鏈復合物。信號檢測包括顯色反應、熒光染色和性同位素標記等步驟,目的是可視化目標核酸序列的分布。

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